如何解決倒置熒光顯微鏡使用常見問題？

倒置熒光顯微鏡是細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和很多生物研究中常用的儀器，相比共聚焦顯微鏡，倒置熒光顯微鏡的成像精度雖然稍低，但儀器更普及，更容易買到或者約到，而且使用維護(hù)都更簡單點(diǎn)。今天我們就給大家分享下倒置熒光顯微鏡使用可能遇到的常見問題，以及可能的解決辦法。

·什么是倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡MF52-CF

倒置熒光顯微鏡由倒置顯微鏡和落射熒光模塊組成，倒置顯微鏡是相對正置顯微鏡的概念，其物鏡、照明系統(tǒng)相對樣品的位置是顛倒的；落射熒光模塊是熒光觀察的核心部件，有轉(zhuǎn)盤式熒光模塊和集成熒光模塊兩種，轉(zhuǎn)盤式后期可升級，但需要獨(dú)立的熒光光源燈箱，用轉(zhuǎn)盤式模塊的倒置熒光顯微鏡更大、更重、更貴。

·為什么要用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡通常最高只會配40X物鏡，因此放大倍率、分辨率不如正置熒光顯微鏡，但勝在應(yīng)用層面更方便好用。

倒置熒光顯微鏡觀察多孔板

首先倒置熒光顯微鏡的物鏡有更長工具距離，可以適配各種培養(yǎng)皿從底部直接成像，從而節(jié)省了反復(fù)制樣做玻片的麻煩，效率更高更適合大批量、多視野培養(yǎng)細(xì)胞等樣品的觀察。

倒置熒光顯微鏡觀察無沾染觀察

另一點(diǎn)優(yōu)勢是倒置熒光顯微鏡可以無沾染觀察，無沾染意思是因?yàn)橛^察無需打開培養(yǎng)皿，可避免取樣制樣帶來的沾染污染風(fēng)險。

倒置熒光顯微MF53-N搭配顯微操作系統(tǒng)

最后一個倒置熒光顯微鏡的優(yōu)勢是更大的工作空間，因?yàn)榈怪脽晒怙@微的明場照明系統(tǒng)采用的是長工作距離聚光鏡，因此載物臺上方有更大空間，更方便安裝使用顯微操作系統(tǒng)等配件。

·怎么使用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡相襯和熒光疊加成像

倒置熒光顯微鏡通常可以實(shí)現(xiàn)明場、相襯和熒光觀察，如果儀器附近有貼SOP或者說明書，可以看看，快速上手。明場觀察很簡單，可以看病理切片等樣品，這里不贅述；相襯觀察需要切換到相襯物鏡，然后把上光源光強(qiáng)調(diào)高，聚光鏡光闌調(diào)到PHP位置（最大位置），切換相襯環(huán)板到對應(yīng)的位置即可；難點(diǎn)是熒光觀察，不同倒置熒光顯微鏡有不同結(jié)構(gòu)，大致可以分為研究級倒置熒光顯微鏡和新型倒置熒光顯微鏡兩種，我們分別以MF53-N和MF52-N為例進(jìn)行說明。

研究級倒置熒光顯微鏡MF53-N

MF53-N是研究級倒置熒光顯微鏡的代表，它采用轉(zhuǎn)盤式熒光模塊，可以按需選擇不同的熒光激發(fā)塊，背面帶熒光燈箱接口，可以使用大功率寬光譜LED熒光光源MG-100、四通道光源MG-120或者汞燈等作為熒光光源。

這種倒置熒光顯微鏡會有獨(dú)立的光源控制器，首先關(guān)閉明場光源，通過控制器打開熒光光源，調(diào)節(jié)光強(qiáng)，然后轉(zhuǎn)盤選擇熒光通道，放樣品，操作對焦，再切換分光拉桿到相機(jī)成像拍照。不同熒光通道需要分別調(diào)節(jié)光強(qiáng)并拍照，如果是MG-100或者M(jìn)G-120，光源可以即開即用，亮度可自由調(diào)節(jié)，比較方便，而汞燈使用需要預(yù)熱、亮度只能靠ND減光鏡控制，操作更復(fù)雜，也更容易出各種問題。

倒置熒光顯微鏡MF52-N

MF52-N是新型倒置熒光顯微鏡的代表，它采用高度集成的數(shù)顯LED熒光模塊，不需要外接熒光燈箱和控制器，能直接在模塊上控制熒光開關(guān)、光強(qiáng)設(shè)置和通道切換等操作，并提供數(shù)據(jù)化光強(qiáng)顯示，可以配備3個熒光通道，滿足BGU等常見的熒光觀察需要，更易于使用。

新型倒置熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)比研究級簡單，首先關(guān)閉明場光源，打開模塊上的光源開關(guān)，然后拉桿切換熒光通道并調(diào)節(jié)光強(qiáng)，放樣品，后續(xù)操作和研究級一樣就行。奧林巴斯CKX41、CKX53都可以通過明美的倒置熒光模塊升級成類似的新型倒置熒光顯微鏡。

升級熒光觀察的DMIL

另外，尼康TS100、徠卡DMIL這兩款無限遠(yuǎn)光學(xué)倒置，也能通過我們的熒光模塊和熒光光源升級成倒置熒光顯微鏡，但它們都是外掛熒光光源搭配推拉切換熒光通道的設(shè)計(jì)，用起來比一般的新型倒置熒光顯微鏡復(fù)雜些。

·怎么拍出好的熒光圖片？

高靈敏度相機(jī)成像更好

這是很多實(shí)驗(yàn)操作人員非常關(guān)心的問題，首先要說明的一點(diǎn)是，倒置熒光顯微鏡的光路結(jié)構(gòu)比正置熒光顯微鏡復(fù)雜，光損更大，因此熒光拍照難度比正置高，需要比較高靈敏度的相機(jī)，比如MSX11、MC50-S等，尤其一些采用了固定分光設(shè)計(jì)的倒置熒光顯微鏡。

半復(fù)消色差物鏡效果更好

第二個點(diǎn)是選擇合適的物鏡，落射熒光觀察中激發(fā)光和發(fā)射光都需要經(jīng)過物鏡一趟，物鏡熒光通過率低的話會導(dǎo)致光損非常大，一般的相襯物鏡、帶厚度適配環(huán)的物鏡都有較大光損，可以的話應(yīng)該選擇半復(fù)消色差的相襯物鏡/普通物鏡，它們上面會有SAPO（Semi-APO）、PL FL、Fluor之類標(biāo)記，如果有APO標(biāo)記的復(fù)消色差的物鏡更好，如果沒有半復(fù)消色差用Plan標(biāo)記的平場消色差的物鏡也還能湊合。

多色熒光需要分別微調(diào)對焦

第三個點(diǎn)是對焦，不同熒光通道的波長不同，焦面會有一定的偏移，因此不同熒光通道需要分別微調(diào)對焦才能獲得更銳利的成像，明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)軟件界面下方的清晰度狀態(tài)數(shù)據(jù)可以為對焦提供參考。如果您是半復(fù)消色差的相襯物鏡，還能先在相襯下對好焦，再切換到熒光拍照，減少淬滅的可能性。

·可能遇到哪些常見問題？

倒置熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)比共聚焦簡單，出問題的機(jī)率更低，但并不是不會出問題，好消息是很多問題可能簡單處理一下也能排除。

熒光模塊沒轉(zhuǎn)到位會擋住激發(fā)光

常見問題1：完全沒有激發(fā)光。從光源開始檢查光路，光源接好并打開了嗎？熒光切換機(jī)構(gòu)是否旋轉(zhuǎn)到位/拉桿切換到位了？是否有錯位的ND濾鏡？是否Shutter關(guān)上了？如果整個光路都正常，可能就是光源壞了，對于汞燈就是換燈泡，LED熒光光源可能換個通道還能用，因?yàn)椴煌瑹晒馔ǖ缹?yīng)的是不同的LED燈珠/燈珠陣列。

分光拉桿沒拉到位會沒有成像

常見問題2：有激發(fā)光但沒成像。先觀察分光欄桿，分光欄桿沒到位的話目鏡和相機(jī)都會沒有成像，目鏡通常很好確認(rèn)有無熒光，除非是CY5之類肉眼看不見的近紅外波長。目鏡有成像，相機(jī)看不到就要調(diào)整曝光時間和曝光增益，如果近期升級過系統(tǒng)可能還有驅(qū)動失效之類問題。如果最終成像細(xì)節(jié)較差、容易過曝，基本就是相機(jī)靈敏度太低的問題，除了升級相機(jī)沒有什么好方法解決。

亂動燈箱上的旋鈕會導(dǎo)致熒光不均勻

常見問題3：有成像但有異常瑕疵，就要看情況。比如熒光不均勻，可能是熒光燈箱調(diào)錯了聚光位置；有強(qiáng)熒光背景，可能是上聚光鏡反光了，上聚光鏡有擋板的用擋板，無擋板的收小光闌也可能有用；FITC和TRITC完全重疊、有信號但預(yù)期目標(biāo)沒染出來，可能不是儀器問題，是出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，需要重新檢查染色流程是不是做錯了。

·倒置熒光顯微鏡能不能用高倍油浸物鏡？

一般來說倒置熒光顯微鏡配備的物鏡最高只有40X，因?yàn)榈怪脽晒怙@微鏡的上聚光鏡NA數(shù)值孔徑不到0.6，無法匹配60X/100X等高數(shù)值孔徑物鏡。但如果只看熒光觀察的話，其實(shí)倒置熒光顯微鏡是可以搭配100X油浸物鏡使用的，需要注意的是，100X物鏡是為0.17厚度的蓋玻片校正的，因此需要使用0.17厚度的共聚焦培養(yǎng)皿或者反轉(zhuǎn)放置的細(xì)胞爬片。

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